基因敲出 基因敲出技术简介

genechip

1、概念
基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。
基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。

2、技术路线
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。
基因敲除的技术路线如下：
（1）构建重组基因载体﹔
（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内﹔
（3）用选择培养基筛选已击中的细胞﹔
（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。

基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此，同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大学的Capecchi教授的研究组发展的"正负双向选择系统"适用范围宽且效率较高。

二、主要应用领域及国内外研究进展
ES细胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术的成熟，首次使体外精细的基因操作与小鼠的整个生长发育和生命过程得到了直接的结合，为探讨高等动物基因组结构和功能提供了有效的方法。由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对哺乳类生物学的各领域，包括发育生物学、癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗传学产生了极大影响。理论上，基因敲除可适用于任何能产生ES细胞的物种，将来可在小鼠基因敲除成熟的基础上开展其它实验动物的基因敲除工作。

基因敲除的应用领域主要有：
1、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料
基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分子基础及诊断治疗的重要实验材料。如1989年囊性纤维化病（CF）的致病基因（CFTR）被成功地克隆，1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，为CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利通过了通过了基因治疗的动物试验，于1993年开始临床试验并获得成功。
2、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学
深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物效应提供模式。例如，目前人类基因组研究多由新基因序列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、LTD有缺陷的基因敲除动物，发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少。

3、治疗遗传病。
这包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的。
4、改造生物、培育新的生物品种

细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景。

基因敲除技术在国外已是成熟技术，国内还仅仅是刚刚开始。但是，国内已有几家单位在这一领域开展了一些工作。例如，利用基因敲除系统，军事医学科学院杨晓研究了Smad3基因的功能﹔上海生化所李亦平成功地鉴定了3个与骨骼发育有关的新基因﹔安徽中医学院蔡钦朝等探讨了肿瘤坏死因子受体Ⅱ在郎格罕细胞迁移中的作用、CD45蛋白酪氨酸磷酸酶与小鼠表皮γδT细胞发育的关系﹔南京大学张春妮等研究了极低密度脂蛋白和中间密度脂蛋白与动脉硬化的关系﹔第二军医大学戴旭明等将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ(mFⅨ)基因定向敲除，为建立血友病B的转基因小鼠模型奠定了基础。