植物总RNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析

wangsheng0726

植物总RNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析
【实验目的】
熟悉植物总RNA提取及提取RNA质量的琼脂糖凝胶电泳分析方法。
【实验原理】
用含有异硫氰酸胍变性剂的提取液抽提植物组织粉末，一方面可以和β-巯基乙醇联合作用高效抑制RNase的活性，防止RNA的降解，另一方面又可使蛋白质变性并使其溶解，在酸性条件，提取液进一步经过酚/氯仿抽提去除蛋白质、DNA、多糖等杂质，(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费送)RNA可被异丙醇沉淀。
【器材与试剂】
1．实验仪器  高速冷冻离心机，陶瓷研钵，液氮罐，微量移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪，水浴锅，烘箱(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)2．实验试剂  提取液：4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠（pH 7.0），0.5％ 十二烷基肌氨酸钠，0.1 mol/L β-巯基乙醇；醋酸钠溶液（2 mol/L ,pH 4.0），水饱和苯酚（pH 3.5），氯仿/异戊醇（24：1，v/v），乙醇，异丙醇，焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，简称DEPC），琼脂糖，甲醛，10×电泳缓冲溶液：200 mmol/L吗啉代丙磺酸（pH7.0），20 mmol/L醋酸钠，10 mmol/L EDTA（pH8.0），过滤除菌后避光保存；5×载样缓冲溶液：16 μL水饱和溴酚蓝，80 μL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），720 μL 37%甲醛，2 mL甘油，3.084 mL甲酰胺，4 mL 10×电泳缓冲溶液，加DEPC处理过的水至10 mL,4℃保存；0.5 μg/mL溴化乙锭染色液（1×电泳缓冲溶液配制）
3.  实验材料 新鲜的烟草叶片
【实验步骤】一、RNA的提取
1. 取两只10 mL离心管，各加入3 mL冰冷的提取液，置于冰上。
2. 取0.5 g新鲜的烟草叶片组织放在液氮预冷的研钵中，(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装 )倒入液氮，迅速研磨成粉末。 3. 将粉末移入盛有提取液的离心管中，振荡，使植物材料和溶液充分混合，后将离心管置于冰上。
4. 向离心管中依次加入0.3 mL醋酸钠溶液、3 mL水饱和酚和1 mL氯仿/异戊醇，快速颠倒离心管数十次，冰上放置15 min。
5. 4℃，12 000×g离心30 min, 将上层水相转移到另一个离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃静置30 min。
6. 4℃,12 000 ×g离心20min，弃上清，倒置离心管使溶液尽可能流干，沉淀重新溶于0.7 mL提取液，4℃,12 000 ×g离心10min，上清移入一1.5 mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀后，-20℃静置30 min。
7. 4℃，12 000×g离心30min，弃上清，沉淀用70％乙醇润洗一次，用微量移液器吸走乙醇溶液，室温放置使残留乙醇挥发干净，加入50 μL DEPC处理的水溶解，得RNA溶液。
二、变性琼脂糖凝胶电泳
1．称取1.5 g 琼脂糖，加入DEPC处理的水72 mL，加热溶化后，冷却到50～60℃，再依次加入10×电泳缓冲溶液10 mL和甲醛18 mL，混匀后制胶。
2．取16 μL RNA溶液放入一Eppendorf管中，加入4 μL 5×载样缓冲溶液，65℃保温5 min，迅速置于冰上，上样前短暂离心。
3．点样后，80V恒压电泳，溴酚蓝迁移超过凝胶的1/2处时停止电泳。
1．        凝胶用溴化乙锭染色液染色30 min，紫外等下观察。
【注意事项】(Q往圣科技3452125268提供免费基因慢病毒包装)
1．为尽可能的避免RNA的降解，实验所用玻璃器皿洗净后必须于烘箱内于180℃烘烤8 h以上，所用的溶液及塑料器皿必须用DEPC处理，操作环境尽量干净。
2. 为了减少RNase污染并避免DEPC、溴化乙锭、甲醛等对人体的毒害，实验过程中应戴手套操作，并经常更换。