新一代测序技术-个人基因组时代即将到来

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人类基因组计划（Human genome project, HGP）用了大约10年的时间，各国政府相继投入了几十亿美元，才完成了人类个体全基因组序列的测序工作。而2005年以来，出现的下一代测序技术，却可在1个月内，花费十多万美元就可完成一个人类个体全基因组序列的测序工作。现在，美国、欧洲等各大生物技术公司、大型生物医药研究机构等投入大量的人力物力开始了新一轮的下一代测序技术的技术竞赛，力争实现1000美元完成一个人的全基因组序列的测序，加速个人基因组时代的到来。
       
        下一代测序技术又称为二代测序技术，其代表技术为罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roche GS FLX sequencer), Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。它们的共同特点为：
       
         1.集成了生物医学、计算机、微电子学、光学、材料科学和精密加工等多学科技术。例如，Roche GS FLX sequencer的图像采集技术就借鉴现代天文望远镜的光学系统技术，即超高分辨率的CCD集成光纤束技术。

         2.测序策略主要基于循环芯片测序法（Cyclic-array sequencing），即制备DNA文库，单分子扩增，在固相载体上形成DNA簇阵列，并行地利用DNA聚合酶或者连接酶进行酶促反应（模板变性、引物退火杂交、延伸或连接），同时读取反应产生的特异性荧光信号，最终得到超大量的DNA序列信息。

         3.高通量并行测序。例如，Roche GS FLX sequencer一次就可对上百万条DNA分子同时进行序列测定，一次运行通量达到400Mb以上，而传统测序（一代测序）一轮测序的通量仅为80Kb左右。

         4.单分子测序。传统测序（一代测序）是对多个DNA分子的混合物进行测序，其测序结果是多个DNA分子综合的序列信息；而二代测序先对单个DNA分子进行PCR以放大DNA分子数量（相当于单个DNA分子的克隆复制），再对这些DNA分子进行测序，就可以得到原来单个DNA分子的序列信息。

        下一代测序技术竞赛的目标就是如何花费1000美元在几天内就能对一个人的全基因组进行测序。目前二代测序技术还做不到这一点。要实现这个目标，必须发展出比二代测序技术更高通量，更加便宜的测序技术（三代测序技术）。这需解决三个技术难点：
       
         1 不需要制备DNA文库及对DNA片段进行单分子扩增。
          由于荧光分子信号强度及CCD对荧光信号的检测灵敏度等方面限制，测序时还不能有效地实现对单个荧光分子信号的检测，需要制备DNA文库及对DNA片段进行单分子扩增，放大测序反应时的荧光信号。但文库制备等步骤增加了测序所需成本及时间。

         2 更快的测序速度。
          目前的二代测序技术需对测序反应中每一步碱基延伸进行控制，例如每一步反应后反应残留物洗脱，荧光基团去除等。因此二代测序对一个DNA分子的测序速度明显低于传统测序。要达到或超过传统测序的速度，很可能需要全新的测序策略才能解决。

         3 更高的测序并行度。
          二代测序是基于荧光信号进行检测，测序并行度会受到光衍射极限的限制。一般而言，二代测序反应所需的微球直径越小，一轮测序反应能够检测到的DNA分子就会越多，但微球直径接近1μm时，就会受到光衍射极限的限制。不过目前测序并行度并未受到光衍射极限的限制，还有很大的提高空间，这需要开发出更高分辨率的CCD等方面配合。

        已经在研发的三代测序技术部分克服了以上难点。如：HeliScope测序仪无需对基因组进行扩增，采用极高灵敏度的荧光检测仪识别测序时的荧光信号。Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）也无需对基因组进行扩增，而且测序速度很快。这种技术将单个DNA聚合酶固定在一种直径只有几十纳米的孔中，无需对每一步测序反应（碱基延伸）进行控制，充分利用DNA聚合酶的特性，实现高速测序以及超长片段测序。ABI（Ion Torrent）新一代测序仪则利用硅芯片检测测序反应时氢离子的转移。由于不需要荧光标记，有效降低了测序成本。而Oxford Nanopore的纳米孔测序技术也不需要荧光标记，使用核酸外切酶消化单链DNA分子，逐一剪切下单个碱基，在纳米孔中通过电流变化识别剪切下的碱基，其技术特点是测序速度快，测序长度长，成本低廉。
       
        新一代测序技术的应用领域相当广泛，除了在科研领域（例如通过人类基因组上的SNP位点、基因缺失、基因拷贝数变异来分析研究人类基因的多态性等），在临床医学及食品安全领域也有着广泛的应用前景。
       
        临床医学：
遗传病的诊断
        遗传病是一种人类基因组DNA缺陷，即由基因突变或染色体畸变造成的疾病，包括单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病等。通过下一代测序技术强大的测序能力，就可分析出待检者的全部基因组中哪部分基因存在缺陷，一方面可以找到很多病因不明的遗传病的致病基因，另一方面结合产前筛查，可以有效的避免遗传病患儿的诞生，这对提高我们中华民族的人口质量，减少出生缺陷、残疾等至关重要。
       
传染性疾病的快速诊断
        传染性疾病的突然爆发造成严重的公共安全威胁，但在疾病爆发初期往往没有有效的检测手段能快速鉴定出病原体，特别是未知的病原体。一个典型例子就是2003年的SARS（传染性冠状病毒肺炎），是由一种具有强传染性的新型冠状病毒在人群中快速传播引起。而通过下一代测序技术，我们可快速检测分析出一个个体内基因组中有无外来病原体的基因序列，根据这些序列信息就能鉴定出人群中感染的病原体，为较短时间内制定疫情防控策略提供科学依据和坚实保障，避免疾病的大规模爆发流行。
       
个体化医疗
        由于人类全基因组测序工作的完成以及对疾病与基因关系的深入研究，现在的临床医学已由群体治疗向个体化医疗转变，即根据个体的遗传学信息来针对性的制定预防疾病的措施以及合理的治疗方案。肿瘤的靶向治疗就是一个成功应用。另外，临床研究表明很多重大疾病往往与多个基因密切相关，而不是由单个基因决定。这些都需要我们对个体的遗传学信息有全面准确的了解，因此具有强大的测序能力的下一代测序技术显得至关重要。

食品安全：
        在食品安全领域，下一代测序技术同样有着广泛应用的前景。食品安全是各国公共安全的焦点，其中相当重要的问题是致病微生物污染食品导致的食源性疾病。根据世卫组织统计，每年全球发生的食源性疾病数以亿计。发达国家如美国每年因食源性疾病带来的医疗费用及相关损失达几十亿美元。此外，群体食源性疾病的爆发还会给社会带来严重的公共安全问题。由于可污染食品的致病微生物种类繁多，如何及时有效地检测出食品中致病微生物是哪一种，目前仍是一个巨大挑战。下一代测序技术是一个很好解决方案，利用其强大测序能力，可同时对食品中等所有微生物的基因组进行测序，有效鉴定出食品是否存在以及何种致病微生物污染。