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第三节
药物作用靶点发掘 Section 3 Mining Drug Targets 一、药物靶点概述 药物靶点主要是特定物质代谢途径或信号通路的关键成分，包括人体的特定大分子、小分子或病原微生物的特定对应成分。如控制胞内特定离子稳态浓度的离子通道、水解灭活环核苷酸的PDE、控制花生四烯酸(arachidonate)代谢成炎症介质的环加氧酶、激活腺苷酸环化酶生成cAMP的肾上腺素受体。体内的代谢途径交叉连接，有的物质也会参与多个代谢途径；体内的信号通路之间也有交叉连接，有些成分能同时参与不同的信号通路(图17-2)。因此，有效的药物靶点需具备如下特征：①对影响疾病病理过程的物质代谢途径或信号通路有控制作用；②尽可能位于诱发疾病病理过程物质代谢途径中生成该物质的最终环节，或疾病密切相关信号通路下游与疾病发生物质代谢途径直接交换信息的关联环节；③尽可能不参与人体其他组织或细胞生命活动所必需的代谢过程或信号传递过程;
④尽可能避开多个代谢途径或信号通路的交叉点。显然，作为一个有效的药物靶点，上述第一个特征是所需具备的必要条件，而后面的三个特征主要是充分条件。小分子靶点的识别过程相对直接，大分子靶点的识别与确认过程就很复杂。 图17-2 单个细胞内NF-kB参与信号通路的连接和交叉 病原微生物通常有决定其致病能力且人体不需要的代谢途径，人体正常代谢不需要而此代谢途径必需的任何独特性成分都是潜在的药物靶点；如病原细菌或真菌常需合成人体不需要的细胞壁，其细胞壁合成的所有独特性关键酶都是理想的靶点。体内用于启动病理过程的信号通路关键成分都是合适的药物靶点，如费城染色体阳性的慢性髓系白血病中Bcr/Abl激酶是其治疗的理想靶点，其选择性抑制剂伊马替尼(imatinib)是低毒性抗肿瘤药物。体内相同代谢途径在不同细胞中可发挥不同作用，分化的组织器官和细胞含有控制对应物质局部稳态水平的受体亚型或同工酶可作为合适的药物靶点，如环鸟苷酸(cyclic guanidine nucleotide, cGMP)对多数细胞生理活动有重要调节作用，但PDE5是阴茎海绵体cGMP稳态水平的主要控制者而不是其他组织细胞中cGMP稳态水平的主要控制者，因此PDE5同工酶选择性抑制剂seldinafil是疗效显著的药物。人体蛋白质类药物靶点可分成几个主要的家族(表17-1)。 表17-1 人体蛋白质中的常用药物靶点 | | G-protein coupled receptors | | | | | | | | | | | |
用生物信息学技术发掘药物靶点是新药发现的基础。随着对疾病认识的积累，发现了大批药物靶点，目前已确认的药物靶点约500个。随着各种高通量测定数据的获得，新的治疗药物靶点不断地被发现，预期人体自身的蛋白质类靶点总数可达到3000个。人类基因组计划的积极推进和各种疾病相关代谢途径、相互作用分子网络、基因表达和蛋白质谱及病原微生物基因组和蛋白组数据的积累，成为发掘药物作用新靶点的基础，奠定了新药发现的重要基础。 分析大量数据发掘潜在的药物新靶点主要有两种策略。一种以实验测定疾病与健康个体的相关数据为主进行比较分析推断与疾病发生相关的基因和蛋白质，并推断其功能和作为候选药物新靶点的可能性；另一种分析基因组或蛋白质的序列数据，通过药物靶蛋白的序列特征进行模式识别分类判断候选序列作为潜在药物靶点的可能性。以下简介这两类常用策略。 二、分析基因组和基因型数据发掘潜在的候选药物靶点 分析基因组数据发掘药物靶点的最直接应用是寻找病原微生物的基因组中与人体细胞代谢不同而对病原微生物的生长和致病必需的基因产物作为候选药物靶点。对于病原微生物生长和致病所需而人体不需的代谢途径，包括该途径的小分子物质，都是理想的药物靶点。即使是人体和病原微生物共同的代谢途径，例如嘧啶核苷酸合成代谢途径，不同的进化层次使得病原细菌对应代谢途径的某些关键酶和人体对应代谢途径的关键酶编码序列也有显著差异，对应的关键酶的活性中心精细结构存在差异。基于这种序列差异和预测的功能域精细三维结构的差异仍然能设计出针对病原菌代谢途径关键酶的高选择性小分子药物。另外，对于某些特殊的微生物，其亚型不同则致病能力显著不同。对于这些病原微生物，分析其基因型数据寻找对应的差异基因是发现新的抗感染药物靶点的有效策略。例如肺炎链球菌的荚膜型和光滑型两种亚型明显致病能力不同，故与荚膜形成相关的基因信息必定是独特数据，对应的编码蛋白都是候选的药物靶点。 分析人体基因组数据发掘候选药物靶点的应用难度相对较大。人体基因组太大，需要一定的线索关联以缩小需要测序分析的基因范围。分析不同基因的位点多态性等与疾病发生的内在联系，是寻找潜在的候选靶点的有用策略之一。通过这种策略发现与疾病发生关联的基因如属于人体内常用的药物靶点蛋白家族，则其作为新的药物靶点的可能性就很大。 另一种策略是分析功能基因组，解析新基因的功能并考察其是否属于目前常用的药物靶点蛋白家族(表17-1)。其中分析酵母基因组和对应基因功能是用实验验证新基因潜在功能的有效策略。目前，关于酵母的信息资源相对齐全，其基因组、蛋白质组、蛋白质相互作用网络、蛋白质定位、缺失突变表型等都有对应数据库，且新的数据还在增加。通过转入基因考察功能的增强、敲除基因和功能的缺失、小分子RNA干扰目标基因表达，都是验证基因功能的有效策略。人体基因组中与酵母基因组中进化同源的蛋白质有类似的功能，这可用于预测人体新基因的潜在功能及是否可作为潜在的药物靶点。这种策略是疾病相关功能基因组学的重要工作之一。 三、分析表达谱数据发掘潜在的药物靶点 发掘基因表达谱中随着疾病进程表达显著变化的基因，是寻找潜在药物靶点的常用策略。而比较疾病与健康个体表达谱，寻找编码常见药物靶点蛋白质的基因表达差异与疾病发生的关联，是快速发现潜在药物靶点的有效策略。 另一方面，对表达标签和蛋白质组学数据的比较分析，尤其和药物蛋白质组学技术联合应用，能快速获得有价值的信息。用未知靶点但明确有效的天然产物作用于疾病的动物或细胞模型，通过蛋白质组学技术分析药物作用下发生改变的蛋白质，这些蛋白质通常与药物的治疗作用明确相关，也与此类药物靶点参与的疾病发生机制有关。应用这种策略的典型代表，如从近海生长的海绵中分离的天然产物Bengamide在体内外都有明显抗肿瘤作用。将此天然产物修饰成药效更强的衍生物LAF389作用于小细胞肺癌细胞系H1299，发现了二十多个表达有差异的蛋白质，并用蛋白质的肽质量指纹图谱对这些蛋白质进行了鉴定；进一步分析发现LAF389阻断了一种特殊蛋白的N-端脱甲硫氨酸，并最终证实LAF389是甲硫氨酸氨肽酶(methionine aminopeptidase, MetAP)的强效抑制剂，且获得了其复合物的晶体结构(1QZY.pdb)（图17-3)。此策略提供了两个重要信息，即MetAP参与的代谢途径中，需要MetAP脱甲硫氨酸的对应目标蛋白底物(其地位相当于代谢途径中的小分子物质)和MetAP本身都是潜在的抗肿瘤药物靶点。 图17-3 甲硫氨酸氨肽酶和Bengamide衍生物的复合物 中间的配体显示为树枝状，绿色为C原子，红色为氧原子，蓝色为氮原子 四、分析序列数据发掘药物靶点 分析序列信息判断对应蛋白质是否为潜在药物靶点的策略集中分析已知药物靶点的序列特征，通过机器学习等方法从中发掘规律并形成判断方法，用于分类或判断候选序列是否为靶点。这属于典型的生物信息学策略，各种模式识别的方法都可用于发掘靶点的序列特征用于建立对应的判断方法。 一个代表性的应用是从已知药物靶蛋白质的氨基酸序列中提取氨基酸残基组成、氨基酸残基的理化性质(包括疏水性、极性、电荷、溶剂可及性等，详见第十章和本章第四节)等信息，用支持向量机模型，用特定核函数(线性、多项式或径向基本函数RBF)和已知靶蛋白数据为训练集，所建立判断分类方法的正确率接近80%。经过优化训练数据集和核函数后，盲法测试的特异性、灵敏度和正确率都能达到80%以上，用这种策略预测潜在的人体靶蛋白有一千多个。 五、反向对接分析配体作用位点寻找靶点 基于分子对接寻找候选配体的方法，可用已知体内和体外活性配体，从已知蛋白质晶体结构的数据库中搜索对应的潜在靶蛋白，这是一种新的靶点发现策略。这种策略对发掘有明确药理活性天然产物的作用靶点具有重要价值。此策略目前已有对应的在线免费服务器和程序可用(http://www.dddc.ac.cn/tarfisdock/)，并有对应的潜在治疗性靶点的数据库。这对很多未知靶点却有明确治疗价值的配体药物靶点发掘和基于靶点结构的配体结构优化策略是一个很好的方向。 六、识别与证实靶点的实验设计策略 从大量数据中发掘出来的候选大分子靶点还需用实验多方面验证。前面已提到有效药物靶点所需要的基本特征。体内蛋白质种类非常多，药物只有选择性作用于靶点才能有所需治疗作用和尽可能少的副作用。通常要确认一个有效的药物靶点可用针对该靶点的已有工具药物或临床药物，但对用生物信息学策略发现的候选新靶点通常没有这类工具配体，只能多角度反复交叉验证候选新靶点的有效性。 小分子药物的作用通常没有组织选择性而大分子药物主要在循环体系发挥作用，故一个靶点在体内如分布很广或参与其他组织的很多必需代谢过程就难以成为有效的药物靶点。同时，验证候选大分子靶点的有效性一般需要确认下特征：①候选靶点的功能与动物模型中疾病发生的病理学过程存在必然联系；②细胞模型中表达的靶点功能与疾病发生的细胞病理学过程存在必然联系；③在疾病动物模型中，(工具)配体达到有效浓度时能与靶点发生明确相互作用；④靶点和药物间离体的相互作用数据可预测动物模型体内的(工具)配体与靶点相互作用；⑤体内靶点含量或活性与病理学过程有明确联系。在验证这些特征时，还需同时考虑所用动物模型是否能够真实模拟人体疾病、存在种属差异性时如何进行替代验证、不同靶点应用于发现小分子及大分子药物的适用性差异等问题。 （一）分析动物疾病模型考察候选靶点与病理学过程的联系 从疾病发生病理学角度确认药物靶点的有效性，需测定靶点功能增强、正常及抑制等情况下疾病病理过程的变化。实现此目的一般需建立疾病的动物模型并改变其靶点的功能，可用公认的对靶点功能有调节作用的工具配体(药物)来探索这种关联性。另外，对大分子靶点，通过基因转染、小分子RNA干扰、核酶等增强或降低靶点的功能考察疾病发生的变化；对小分子靶点，也可直接从外部补充以观察疾病发生过程的变化。在分析这些结果时还需考虑动物模型及不同类型工具药物的有效性差异。 （二）检测细胞模型中表达的靶点考察与疾病发生的细胞病理学过程的关联性 从细胞和分子水平考察疾病发生过程的共性，考察细胞模型中靶点功能的调节对细胞病理学过程的影响。在细胞模型上更容易通过上述技术改变靶点的功能，同时考察同病理相关的物质的变化。尤其在细胞模型中有对应的分子实时显影等技术证实靶点与工具药物之间的直接作用。 （三）考察在疾病动物模型中(工具)药物达到有效浓度时与靶点的相互作用 在活体内测定靶点与(工具)药物相互作用是证实靶点有效性和药物作用机制的最直接证据，但限于技术这类数据在药物靶点研究的前期积累很少。通过标记药物和靶点进行活体成像是考察活体内靶点与药物作用的有效证据之一，这类方法提供的数据主要是来自共定位。 （四）靶点和(工具)药物间离体的相互作用及其是否可用于预测动物模型及人体内的相互作用 各种技术可用于考察离体(工具)药物与靶点的离体相互作用；建立药物作用动态过程的数学模型，可用于模拟(工具)药物在疾病动物模型体内的作用，并与实验测定的疾病动物模型体内的工具药物作用动态变化比较，考察离体的数据用于预测体内作用的有效性。在这些过程中需考虑到小分子药物对预期靶点的分布一般没有严格要求，但大分子药物主要在血液循环系统发挥作用而很难进入细胞内，除非采用特殊的制剂与给药策略，否则大分子药物要求靶点暴露于循环系统。 （五）人体内靶点含量或活性变化及其与病理学过程的联系 对于大分子靶点，应用荧光实时定量PCR、western blotting等技术监测病理变化过程中靶点的含量和活性的变化；对于小分子靶点，应用高效液相层析与MS联用等技术，可监测疾病发生的病理过程中靶点的含量变化。分析疾病发生过程中靶点的含量或活性对控制疾病进程的重要物质含量变化的响应、病理生理紊乱程度的响应，可探索在人体疾病发生发展过程中靶点的作用。 | 
发表于 2011-1-21 02:20:14