质粒DNA的限制性内切酶消化酶解

lixvqing

原理
限制性核酸内切酶能特异地识别双链DNA中的碱基序列，通过“切割”双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键使DNA断裂。利用它可方便地按需要对DNA进行“剪切”加工。限制性核酸内切酶单位的定义为：在限定的温度和反应环境中，1小时消化1μg DNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，在实际使用时需适当增加增加酶量。现在一般用3～5单位的酶消化1μg NDA；反应时间亦可延长到3小时以上乃至过夜；从而使得酶切反应更为完全。内切酶一般均保存在50%的甘油缓冲液中，但进行酶切反应时，过高的甘油浓度会抑制酶活性。在反应体系中甘油的终末浓度不能高于5%，故酶储存液至少需稀释10倍。通常各种核酸内切酶反应都需要Mg2+和一定的盐浓度及适宜的pH，这就需要提供特定的缓冲液。为方便操作，一般习惯于配制10倍浓度的贮存缓冲液，在临用时按1∶10比例稀释即可。现在各厂家均配售各种与酶相应的缓冲液，如配套使用，效果更佳。本实验中所用的pUC19质粒分子总长为2.7kb，经HindⅢ切割后，闭合环状质粒DNA即变成线性DNA分子。
操作步骤：
1. 取Eppendorf管一支，在管中依次加入：

质粒 DNA	10μl(10μg)
10×缓冲液	2μl
Hind Ⅲ(20(U/μl)	2μl
消毒三蒸水	6μl

总体积 20μl
2. 混匀，置离心机中短暂离心数秒钟，使溶液沉于管底。
3. 37℃水浴酶解消化1小时以后，即可进行电泳分析。
仪器与器材
1. 台式离心机 2. 震荡混匀器 3. Eppendorf管
4. 可调式微量移液器 5. 移液器吸头
试剂与材料：
1. 10×缓冲液 2. 限制性内切酶 3. 质粒DNA