重组蛋白的Dot-Western blot 分析

wangsheng0726

重组蛋白的Dot-Western blot 分析
【实验目的】
熟悉利用Dot-Western blot进行微量重组蛋白鉴定分析的原理和方法。
【实验原理】
    微量重组蛋白（纯化或未纯化的）固定在硝酸纤维素（NC）膜上以后，用脱脂奶粉封闭NC膜上其他结合位点，利用兔抗重组蛋白的抗体（一抗）可特异与重组蛋白结合的特点，当NC膜与一抗溶液温育时，(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒加慢病毒包装)抗体可特异结合在重组蛋白上，当NC膜再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG的抗体（二抗兔）溶液温育时，则该抗体可特异的与一抗结合，将NC膜浸泡在含辣根过氧化物酶底物的溶液中，HRP与二氨基联苯胺（DAB）及H2O2反应生成褐色产物，沉淀于NC膜上重组蛋白所在部位，故可以检测目的蛋白的存在。
【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供免费基因慢病毒包装)
1．实验仪器  微量移液器，脱色摇床
2．实验试剂  封闭液：5%脱脂奶粉，150 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；漂洗液：150 mmol/L，NaCl 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；显色液：20 mmol/LTris-Cl,pH8.0，0.1% NiCl2 ，0.01% H2O2 ，0.01% 3,3’二氨基联苯胺（DAB）
3．实验材料  1 mg/mL重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，1 mg/mL牛血清白蛋白，兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清，羊抗兔IgG的抗体
【实验步骤】
1．分别取重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶和牛血清白蛋白（阴性对照）溶液各2 μL点在NC膜上的两处，用铅笔标记。(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)
2．将NC膜放在一个干净培养皿中，加入20 mL封闭液于脱色摇床上温育1 h。
3．加入10 μL兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清（按照抗体效价调整一抗加入量），混匀，继续摇动2 h。(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费送)
4．弃封闭液， NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次，每次10 min。
5．弃漂洗液，重新加入20 mL封闭液和10 μL HRP标记的羊抗兔IgG，混匀，于脱色摇床上温育1 h。
6．弃封闭液，NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次，每次10 min。
7．将NC膜转移到一个干净培养皿，加入20 mL显色液显色,待斑点清晰后，弃显色液。
8．将NC膜浸于蒸馏水中终止反应。(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)
【注意事项】
如果待检测的目的蛋白是牛奶中的某一组分，则不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。