质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析

wangsheng0726

质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析
【实验目的】
熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。
【实验原理】(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)
在碱性条件下，染色体DNA发生变性，共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶液调至中性且有高浓度的盐存在条件下，变性的染色体DNA交联成不溶性的网格结构，变性的染色体DNA与蛋白质发生共沉淀，而质粒DNA仍存在于上清液中，通过离心去除沉淀，溶液中的质粒DNA可被异丙醇沉淀。
DNA在碱性的电泳缓冲溶液中因带负电荷，电泳时向正极移动，不同DNA的电泳迁移率与其分子长度与形态有关，DNA分子越大，则迁移率越小，因此，通过电泳可将不同长度的DNA分子分开。
【器材与试剂】
1．实验仪器   细菌培养箱，控温摇床，高压灭菌锅，微量移液器，高速台式离心机，电泳仪，水平电泳槽，紫外分析仪，pH计，微波炉
2．实验试剂  琼脂粉，100 mg/mL 氨苄青霉素钠，氯仿，异丙醇，70% 乙醇，琼脂糖，溴化乙锭，20 μg/mL RNase A， LB液体培养基，溶液I：50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA, 25 mmol/L Tris-Cl缓冲溶液（pH8.0）；溶液II：0.2 mol/L NaOH，1% SDS；溶液III: 3 mol/L 醋酸钾，5 mol/L 醋酸；TE缓冲溶液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA；TAE缓冲溶液（50×）：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA,pH8.0；载样缓冲溶液（10×）：0.25% 溴酚蓝，30%甘油。(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)
3．实验材料  转化pUC18的大肠杆菌（E.coli DH5α），λDNA/EcoR I, Hind III
【实验步骤】
一、质粒的提取
1．从平板上挑取转化pUC18的大肠杆菌的单菌落，接种于20 mL 含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37 ℃，振荡（250 r/min）培养过夜。
2．取1.2 mL培养物置于Eppendorf管中，10 000 rpm离心1min，弃上清。
3．沉淀菌体用0.1 mL溶液I重新悬浮，加入0.2 mL溶液II，颠倒数次至溶液变得澄清，最后加入0.15 mL溶液III，轻轻颠倒Eppendorf管数次，10 000 rpm离心10 min。
4．上清液移入一个新的Eppendorf管中，加入0.2 mL氯仿，快速颠倒数次，10 000 rpm离心10 min，将上清液移入另一个Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，混匀，10 000 rpm离心10 min，弃上清。
5．向管中加入0.5 mL 70%乙醇，10 000 rpm，离心2 min，弃上清，室温挥干酒精，加入20 μL 含20 μg/mL RNase A 的TE缓冲溶液溶解DNA。
二、琼脂糖凝胶电泳(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)
1．称取1 g 琼脂糖，加入TAE缓冲溶液（1×）100 mL，微波炉加热熔化，配制 1%琼脂糖凝胶，稍微冷却后，倒入制胶模具，插好梳子，待胶凝固后，拔出梳子。
2．将凝胶连同制胶模具放入电泳槽，倒入TAE缓冲溶液（1×）使溶液没过胶面，取9 μL提取的质粒与1 μL栽样缓冲溶液混合，用微量移液器点加到凝胶的加样孔内。(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费送)
3．80～100 V 电泳，当溴酚蓝移动到距凝胶下边沿约1cm处时，停止电泳。
4．将凝胶浸泡在含0.5 μg/mL溴化乙锭的TAE缓冲溶液（1×）中染色30 min，于紫外分析仪内观察结果。
【注意事项】(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)
1．        质粒提取过程中，加入溶液II和溶液III后，要混匀，但动作要轻缓。
2．        质粒沉淀后，由于量比较少，贴在管壁上，在洗涤时不要将其移走。