植物基因组DNA的制备与纯度分析

wangsheng0726

植物基因组DNA的制备与纯度分析
【实验目的】
熟悉植物基因组DNA的提取及其纯度的鉴定方法。
【实验原理】
植物材料经过液氮粉碎，提取液中阳离子型去垢剂十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide，简称为CTAB)能溶解细胞膜和核膜，解聚核蛋白，且与DNA形成复合物，在高盐条件下，Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒
该复合物是可溶的。用氯仿等有机溶剂抽提，可使蛋白质变性，使多糖沉淀，经过离心， CTAB-DNA复合物仍保留在上清液中，降低盐浓度，则CTAB-DNA复合物发生沉淀，沉淀用高盐TE缓冲溶液溶解后，加入异丙醇，CTAB仍在溶液中，但DNA发生沉淀，沉淀溶于TE缓冲溶液中，即得植物基因组DNA。
DNA纯度分析常用的方法有琼脂糖凝胶电泳分析法和紫外分光光度法两种。纯净的DNA溶液是透明的，Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送
用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，OD260/OD280值约为1.8，若二者比值大于1.8，表明样品中含有较多的RNA，若比值小于1.6，则说明样品中含有较多的蛋白质或酚类等杂质。
【器材与试剂】1．实验仪器  台式高速冷冻离心机，微量移液器，水浴锅，液氮罐，陶瓷研钵，紫外分光光度计，高压灭菌锅
2．实验试剂  Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送
β-巯基乙醇，乙醇，异丙醇，CTAB提取液：2% CTAB，0.1 mol/L Tris-Cl,pH8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，20 μg/mL RNase A ，室温保存；CTAB/NaCl溶液：4.1 g NaCl溶解于80 mL蒸馏水，缓缓加入10 g CTAB， 边加热边搅拌至溶解，用蒸馏水定容至100 mL；CTAB沉淀溶液：1% CTAB，50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，10 mmol/L EDTA，pH8.0, 室温保存；氯仿/异戊醇（24：1，v/v）：按24:1的体积比配制，Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送
4℃保存；高盐TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，0.1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，高温灭菌后室温保存；TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA，pH8.0，高温灭菌后室温保存。
3．实验材料  新鲜的烟草叶片
【实验步骤】
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1．向一定量的CTAB提取液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%（v/v），并在水浴锅中将溶液升温到65℃。2．称取1 g烟草叶片，放在用液氮预冷的研钵内, 倒入液氮迅速研磨成粉末，转入无菌的离心管。
1．        加入 4 mL预热到65℃的CTAB提取液，Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装混匀，65℃水浴中保温10～60 min，间或摇动。
4. 向上述离心管中加入4 mL氯仿/异戊醇，颠倒离心管数次，4 ℃，10 000 ×g离心10 min，取上清转移到另一个离心管中。
5. 向上清中加入1/10体积预热到65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒离心管数次。然后加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管数次，Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢室温条件下，10 000×g离心10 min，取上清转移到一个新离心管中。
6．向上清液中加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，颠倒离心管数次，室温条件下，10 000×g离心5 min，弃上清。
7．沉淀用0.5 mL高盐TE缓冲液溶解,Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒加慢病毒包装
然后转移到一无菌Eppendorf管中。若沉淀难于溶解，则可将离心管放在65℃水浴中处理30 min。
8．向盛有DNA溶液的Eppendorf管中加入0.6 mL的异丙醇，混匀，4 ℃，10 000×g离心15 min，弃上清。
9．沉淀用0.5 mL 80%乙醇润洗一次，Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费送
室温干燥，加入0.1 mL TE缓冲液溶解沉淀，得DNA溶液。
10．取5 μL DNA溶液加无菌水至4 mL，放入石英比色皿，用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，计算OD260/OD280，判断所提取DNA的纯度。
【注意事项】
1．        实验时应尽量选用酚含量较低植物的幼嫩组织。
2．        若加入CTAB沉淀溶液后无沉淀析出，表明盐浓度较高，应用CTAB沉淀溶液继续稀释。